【Proteintech】 免疫螢光結果不理想，可能是固定劑和通透劑的鍋 ?！
在所有抗體相關實驗當中，如果說西方點墨法（WB, Western blot）是最樸素無華的，那免疫螢光（IF, Immunofluorescence）一定是最絢爛奪目的那個！
道理我們都懂，IF實驗也做完了~
可是，為什麼我的蛋白定位和別人做的不一致呢？
FEN1抗體（貨號：14768-1-AP）染NIH/3T3細胞
FEN1是一種結構特異性核酸酶，理論上應在細胞核 (nucleus) 表達，前人研究中免疫螢光結果與預期一致，細胞核染色（左圖）。而右圖為使用相同的抗體anti-FEN1（貨號：14768-1-AP）染乙醇固定的NIH/3T3細胞 ，結果細胞質染色，與預期及前人結果相悖。
不要慌! 作為抗體應用專家，免疫螢光小能手，小編這就給研究人員們整理一些，為什麼會出現螢光信號不符的情況？究竟是什麼原因呢？
1. 固定劑
做過細胞IF實驗的小夥伴都知道，在取得樣本之後，很重要的一步就是要對細胞進行固定。固定，顧名思義就是將細胞“固定”起來，這樣能長久的保持細胞形態和抗原狀態，讓抗原能夠與抗體更充分且更穩定地結合。
可有多少實驗者知道，固定劑也會影響蛋白（抗原 antigen）的亞細胞定位（指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位。例如蛋白於核內、胞質內或者細胞膜上存在）實驗結果？
例如，我們研究部分核蛋白（nucleoprotein）時發現如果採用乙醇（ethanol）固定，就會出現細胞質（cytosol）染色的結果。
B23/NPM1抗體（貨號：60096-1-Ig）染MCF-7細胞
左圖4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）固定MCF-7細胞（細胞核染色-陽性），右圖乙醇固定（細胞質染色-非特異性染色）。
而當我們用E-cadherin抗體染細胞膜時，如果採用的是4%多聚甲醛固定，也會出現細胞核假陽性信號。
E-cadherin抗體（貨號：20874-1-AP）為細胞膜染色
左圖4% PFA固定MCF-7細胞（細胞核染色-非特異性染色），右圖乙醇固定（細胞膜染色-陽性）。
顯然，固定劑確實會影響到蛋白（抗原antigen）的亞細胞定位實驗結果。不同固定劑的作用原理不同，不同目標蛋白及所用抗體特性不同，都可能影響到固定劑使用效果。
因此選對合適的固定劑對於準確的 IF 數據是至關重要的。
那麼該如何挑選合適的固定劑呢？且往下看：
常用的固定劑種類很多，一般常用固定劑可分為兩大類：可溶性溶劑和交聯劑
可溶性溶劑： 如丙酮（Propanone/Acetone）、乙醇等能去除脂類物質並使細胞脫水，把蛋白質沉澱在細胞結構上。
交聯劑： 如 PFA 可以通過自由氨基基團把生物分子橋連起來，形成一個相互連接的抗原網。
組織或細胞經過固定後可使胞內蛋白凝固，減少或終止外源性酶（Exogenous enzymes）和內源性酶（Endogenous enzymes）的反應；保持組織或細胞的抗原性，避免抗原發生彌散；保持組織和細胞的固有形態和結構。
不同類型固定劑優缺點如下：
| 可溶性溶劑 (丙酮及醇類固定劑） | 交聯劑 （醛類固定劑） | |
| 優點 | 1.固定時間快2.對組織穿透性強，抗原免疫活性保存較好3. 結構清晰，染色鮮豔4.可溶解膜磷脂（Membrane phospholipid），無需額外通透 | 1.成本較低2.組織收縮較少，損傷少，保存固有物質較好3.固定均勻，穿透性強4.能使組織硬化，增進組織彈性，有利於切片5.能保存脂肪及脂類物質 |
| 缺點 | 1.具有揮發性和毒性大量接觸和吸入對人體有害2.對組織脫水性強，使組織收縮較大 | 1.具有毒性及揮發性還可能導致標本乾涸2.產生福爾馬林色，影響觀察效果Tip： 福爾馬林色又稱甲醛色素，為棕色或棕黑色的沉積物，多出現於血液豐富的組織、出血的損傷區域以及充血的大血管中3.含雜質較多如甲醇，鈍化酵素活性，影響反應 |
Proteintech根據多年抗體開發以及蛋白檢測經驗，總結了一份【不同細胞器首選固定劑方法】，提供實驗者參考
| 不同細胞器首選固定方法 | |||
| 亞細胞器 | 首選固定劑 | 亞細胞器 | 首選固定劑 |
| 細胞膜 Cytoplasmic membrane | A或B | 纖毛 Cilia | A |
| 細胞核 Nucleus | A | 黏著斑 Adhesion plaque | B 或 A |
| 細胞核膜 Nuclear envelope | B 或 A | 溶酶體 Lysosomes | A 或 B |
| 細胞核仁 Nucleolus | B | 線粒體 Mitochondrion | A |
| 核醣體 Ribosome | B | 過氧化物酶體 Peroxisomes | A或B |
| 高爾基體 Golgi complex | A | 自噬體 Autophagosome | B |
| 內質網 Endoplasmic reticulum | A | 細胞骨架（微管） Microtubule | A |
| 中心體 Centrioles | B | 細胞骨架(微絲) Microfilament | A 或 B |
| 紡錘體 Spindle apparatus | A | 細胞骨架（中間纖維） Intermediate filament | B |
| Tip： A：交聯固定劑，PFA等 B：有機溶劑，丙酮、甲醇、乙醇等 | |||
當然，固定劑的選擇其實是沒有通用的規則，以上表格也是經驗之談，不排除有特殊情況。如果沒有達到預期的實驗效果，小夥伴們也可以嘗試更換其他固定試劑。
2. 通透劑
說到了固定劑，那就必須聊一下通透劑，通透劑沒選好同樣會造成IF結果不理想。
交聯固定劑比有機溶劑能更完整的保持細胞結構，保存脂類物質，但也會因此而阻礙抗體-抗原的結合，甚至屏蔽抗原表位（Antigenic epitope），造成陰性檢測結果。
因此可能需要增加一個通透步驟以使抗體能夠順利進入並接觸抗原。我們可以根據目標所處的位置進行選擇使用或者不使用通透劑，以及選擇何種強度的通透劑。
1）檢測胞外表位 如：細胞膜表面蛋白（Membrane protein）、膜整合蛋白（Integral membrane protein）的胞外段等
無需進行通透，固定之後即可檢測。
2）檢測胞內表位 如：膜整合蛋白的胞內段、細胞骨架蛋白、細胞器膜外蛋白等
則需選擇較溫和的細胞通透劑：Digitonin、Leucoperm、Saponin或Tween 20等，這些細胞通透劑能夠在細胞膜上打孔，增加通透性，使抗體進入胞質中並識別胞質中的抗原表位。
3）檢測有膜细胞器内表位 如：核內蛋白、線粒體內的蛋白等
則需要採用強通透劑：Triton X-100和NP-40等，可以部分溶解細胞核膜等細胞器膜結構，使抗體進入細胞器內部識別抗原並結合抗原表位。
3. 其他可能性
總而言之呢，免疫螢光結果不理想，可能的原因非常多，其中固定劑和通透劑的選擇也至關重要的一步，希望大家要牢記！
除此之外的可能原因，倍思特小編總結了一份【免疫螢光疑難解析】，針對各種不理想情況解析了各種可能性，希望對大家有所幫助！
| 免疫螢光疑難解析 | ||
| 效果 | 原因 | 解析 |
| 染色淺/無 | 封閉（Blocking）時間過長 | 封閉時間應保持常溫 1h 左右，或 4℃ 過夜 |
| 抗體濃度過低，作用時間較短 | 提高抗體濃度，作用時間不可少於 1h | |
| 抗體作用溫度不當 | 25-30℃ 作用時間 1-2h如需過夜應置於 4℃ 冰箱內 | |
| 操作過程中緩衝液殘留過多，間接稀釋抗體濃度 | 每步驟用於沖洗的緩衝液盡量瀝乾 | |
| 濾光片選擇不合適 | 更換濾光片 | |
| 染色深 | 封閉時間過短 | 封閉時間應保持常溫 1h 左右，或 4℃ 過夜，可適當提高封閉液濃度 |
| 抗體濃度過高或者作用時間過長 | 降低抗體濃度，抗體作用時間：室溫 1-2h 或 4℃ 過夜 | |
| 洗滌不充分 | 增加緩衝液洗滌次數和時間 | |
| 染色定位不對 | 組織細胞中無抗原 | 設立陽性對照，以驗證實驗結果；換其他組織細胞檢測驗證 |
| 固定方法不當 | 固定劑可分為交聯固定劑和可溶性溶劑固定劑，嘗試換不同類的固定劑處理抗原樣品 | |
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