常常對實驗高背景感到 無奈 嗎?
教你如何獲得 低背景免疫沉澱
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上一篇文章 (你累了嗎? 教你如何省時省力高效完成一次免疫沉澱) 中提到了Nano-Trap於免疫沉澱(Immunoprecipitation, 以下簡稱IP)實驗中所展現的高親和力、耐熱及耐化學穩定性，還有縮短實驗時間等種種優勢。
所以接下來要為各位帶來的是，如何能獲得低背景的IP結果。
那麼想要知道答案，首先便要了解IP的高背景是如何產生的？
(註：I代表Input，FT代表Flow Through，B代表Bound)
IP 實驗中的背景通常來自洗滌步驟中沒有被去除的背景蛋白質。這些背景蛋白通常發生在cell lysate的過程中，並與beads產生非特異性結合。而背景蛋白也可能被 SDS sample buffer沖洗後分離出來，最後在 SDS gel的結合部分(B)顯示出額外的條帶。
簡而言之，蛋白質的非專一性結合由與beads和/或親和試劑 (例如：抗體或奈米抗體Nanobody) 之結合所引起。
那麼知道發生的原因後，再來便是如何能夠避免非專一性結合呢？
非專一性結合之可能物質有三種，皆來自於其與背景蛋白之非特異性結合：Beads、奈米抗體 (Nanobody)、塑膠材料 (Plastic tubes)。
1.Beads與背景蛋白
最直接的解決方法是使用Binding control beads (產品代碼：bab-20 和 bmab-20) 進行預清理(pre-cleaning)。Binding controls是指沒有與奈米抗體連接的beads。將其加入cell lysate中，透過離心或磁力分離，並利用IP確認是否有背景蛋白存在。如果在 SDS gel上的結合部分(B)發現條帶，便可使用此方法以改善 IP 結果。
此外，更嚴格的洗滌條件，例如在wash buffer中加入 0.1% 的介面活性劑(Detergent)，也可以減少與beads的非特異性結合。但是，介面活性劑可能不適合用在 Co-IP上。
2.奈米抗體(Nanobody)與背景蛋白
如果背景蛋白與 GFP Nanobody產生非特異性結合，則建議可以改善wash buffer (見下圖)。由於 GFP-Trap非常穩定，因此可以應用在非常苛刻的洗滌條件，如下。
1) 添加介面活性劑，例如 ：0.1% Triton™ X-100 或 0.05% Nonidet™ P40 Substitute
2) 增加鹽濃度，例如： 150-500 mM NaCl
這些方式都能去除背景蛋白，而且 GFP 所標記的 POI (Protein of interest) 仍然會和beads緊密結合，不會被清洗。
有關Wash buffer的成分，請參考以下經 GFP-Trap 親和樹脂測試的最大濃度兼容成分列表：
| Buffer ingredients | GFP-Trap Agarose or Magnetic Agarose | GFP-Trap Magnetic Particles M-270 |
| DTT | 1 mM | 10 mM |
| Glycerol | 30 % | not tested |
| Guanidine HCl | 4 M | not tested |
| NaCl | 2 M | 2 M |
| Nonidet™ P40 Substitute | tested up to 2 % | tested up to 2 % |
| SDS | 1 % | 0.2% |
| TCEP | 0.2 mM | not tested |
| Triton™ X-100 | tested up to 1 % | tested up to 1 % |
| Urea | 8 M | 8 M |
由於 ChromoTek GFP-Trap 由重組的 GFP Nanobody組成，所以幾乎沒有批次間的差異。因此，wash buffer可用於不同的 GFP-Trap 批次，讓使用上更方便。
3.塑膠材料(Plastic tubes)與背景蛋白
背景也可能由非特異性結合塑膠管(Plastic tubes)表面蛋白質所引起。為避免這種污染，建議在最後一次洗滌步驟中將beads轉移到新的塑膠管(Plastic tubes)中，並且持續更換新的tips和low/non-binding tubes，以及使用帶有界面活性劑的wash buffer。
＊獲得低背景的其他注意事項
1) 增加洗滌步驟的次數和時間以去除非特異性蛋白質背景。
2) 在結合步驟中縮短培養時間。如果培養時間過長，即在 +4°C 下超過 60 分鐘，可能會引起蛋白質聚集，從而導致更高的背景產生。由於 GFP-Trap 的結合反應在 30 分鐘即可完成，因此延長培養時間並不會獲得更高的 IP 產量，只會導致背景變得更深。
3) 特別注意，作為背景蛋白質出現的條帶，實際上有可能是 Co-IP 實驗中 POI 的潛在結合對象。
Binding Controls: Product Formats
| Binding Control Agarose | Binding Control Magnetic Agarose | |
| Matrix | Agarose | Magnetic agarose |
| Particle size | 90 µm | 40 µm |
| Magnetic | No | Yes |
| Code | bab-20 | bmab-20 |
GFP-Trap: Product Formats
| GFP-Trap Agarose(gta) | GFP-Trap Magnetic Agarose(gtma) | GFP-Trap Magnetic ParticlesM-270 (gtd) | |
| Bead type | Porous | Porous | Solid |
| Separation | Centrifugation | Magnet | Magnet |
| Capacity | +++ | +++ | + |
| Size of GFP-POI | Small – large | Small – large | Small – very large |
| Application | ◆ Lowest background◆ High binding capacity→ Matrix of choice | ◆ High binding capacity◆ Easy magnetic separation | ◆ Easy magnetic separation ◆ Large proteins / complexes |
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參考文獻：
https://resources.chromotek.com/blog/low-background-immunoprecipitation
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